Печать

Основными возбудителями иксодового клещевого боррелиоза (ИКБ) являются боррелии комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato. Кроме того, относительно недавно (в 2011 г.) российскими учеными было показано, что и вид B. miyamotoi (который филогенетически отличается от вышеупомянутого комплекса видов) также вносит вклад в заболеваемость ИКБ, вызывая лихорадочные безэритемные формы заболевания. Помимо того, что боррелии вызывают заболевания человека (а риск заболеть ИКБ намного выше, чем клещевым энцефалитом, в связи с высокой зараженностью клещей боррелиями), они интересны и сами по себе. Чего только стоит, например, огромное разнообразие плазмид (21!), нехарактерное для большинства микроорганизмов, или способность боррелий уходить от иммунного ответа - ведь до сих пор нет вакцины от боррелиоза, несмотря на многочисленные попытки её создания. 

В нашей лаборатории мы поставили себе несколько задач по изучению боррелий, которые, по нашему мнению, не были решены до настоящего времени:

1) научиться определять видовую принадлежность боррелий на основе видоспецифичной полимеразной реакции (ПЦР) в реальном времени и установить соотношение патогенных видов B. afzelii, B. bavariensis, B. garinii и B. miyamotoi в клещах, собранных в разных регионах;

2) применить методику мультилокусного сиквенс-типирования к изолятам боррелий разных видов, выделенным на территории России;

3) попытаться выявить генетическую изменчивость B. miyamotoi азиатского типа на территории России.

Основные результаты отражены в кандидатской диссертации Мухачевой Т.А. (автореферат, презентация)

Определение видовой принадлежности боррелий

 Хотя в литературе описано немало методик определения видовой принадлежности боррелий, нами не было обнаружено таких, которые бы удовлетворяли нашим требованиям: а) одновременная детекция разных видов; б) возможность определения всех наиболее важных видов, встречающихся на территории России. В результате нами была разработана наша собственная методика определения видовой принадлежности боррелий, основанная на использовании ПЦР в реальном времени с флуоресцентно мечеными зондами TaqMan. К сожалению, нам не удалось сделать методику одностадийной, как задумывалось, но и те результаты, которые мы получили при тестировании, оказались удовлетворительными. 

Работа была опубликована в журнале Ticks and Tick-borne Diseases, результаты были доложены на ряде конференций. 

Постер 2013 1  Постер 2013 2

 

Мультилокусное сиквенс-типирование

Схема мультилокусного сиквенс-типирования боррелий была предложена в 2008 году международной группой ученых и заключается в анализе 8 фрагментов генов домашнего хозяйства. 

Одним из важнейших преимуществ метода МЛСТ является наличие и регулярное пополнение общедоступной базы данных Borrelia MLST Database.  На момент начала нашей работы из 1300 штаммов Borrelia burgdorferi s.l., чьи последовательности были представлены в базе данных, только три были выделены на территории России и депонированы японскими учеными. На апрель 2016 г. в базе данных зарегистрировано 675 сиквенс-типов (включая полученные в настоящей работе) и более 1800 штаммов. За период 2011-2014 гг. нами было получено и проанализировано методом МЛСТ 105 объединенных последовательностей 8 генов домашнего хозяйства B. burgdorferi s.l. (общая длина 4785 пар нуклеотидов). Изоляты и образцы ДНК боррелий были выделены в нескольких регионах России – от Санкт-Петербурга до Владивостока. Типированные изоляты принадлежали трем видам боррелий – B. afzelii (29 изолятов), B. garinii (41) и недавно предложенному виду B. bavariensis (35). При этом был выявлен 51 сиквенс-тип, не представленный в базе Borrelia MLST (ST431-446 и ST593-627). Анализ последовательностей показал, что 1) вид B. bavariensis соответствует геногруппе NT29 B. garinii, а B. garinii объединяет геногруппы 20047 и ChY13p; 2) все российские сиквенс-типы B. afzelii были выявлены впервые, большая часть из них формировала обособленную группу, филогенетически близкую изолятам из Китая и Японии; 3) B. bavariensis и B. garinii характеризовались высоким генетическим разнообразием и неоднородным географическим распределением сиквенс-типов. Результаты были опубликованы в журнале Ticks and Tick-borne Diseases.

На апрель 2016 г. в базе данных содержится информация о 164 изолятах из России (включая наши 105) и нам очень приятно, что исследование боррелий методом МЛСТ продолжается и другими исследователями в нашей стране.  

 

Генетическая изменчивость B. miyamotoi

B. miyamotoi представляла для нас большой интерес, так как по сравнению с другими видами боррелий отличалась крайне низкой генетической изменчивостью (т.е. практически её отсутствием за исключением отдельных изолятов, чьи нуклеотидные последовательности были представлены в GenBank). В частности, изоляты B. miyamotoi азиатского типа, выделенные на территории России от Балтийского моря до Дальнего Востока, обладали идентичными последовательностями по нескольким широко используемым генетическим маркерам. Те же результаты мы получили и в нашей лаборатории при исследовании своих образцов. Неинформативность используемых маркеров заставила нас задуматься о разработке системы мультилокусного спейсер-анализа, по смыслу аналогичной мультилокусному сиквенс-типированию, но основанной на изучении последовательностей более вариабельных некодирующих межгенных спейсеров. Для анализа нами были выбраны 8 межгенных спейсеров.

 

К сожалению, сравнение последовательностей B. miyamotoi из разных регионов и переносчиков не выявило никаких различий, за исключением двух образцов из Пермского края, у которых была обнаружена одна нуклеотидная замена. Принимая во внимание полученные и литературные данные, мы высказали предположение о генетической однородности всего азиатского типа B. miyamotoi на территории от Балтийского моря до Японских островов. Статья опубликована в Infection, genetics and evolution.