До 2009 года для изучения эволюции ВКЭ применялся в основном филогенетический подход, основанный на анализе изменчивости нуклеотидных последовательностей вирусного генома. Изменчивость на уровне фенотипа (аминокислотных последовательностей) практически не учитывалась, хотя в отдельных случаях принималась во внимание. Например, при дифференциации ВКЭ на субтипы по одиночной аминокислотной замене (поз. 206 гликопротеина Е) или при дифференциации ВКЭ-Сиб на филогенетические линии (поз. 175 и 234 в том же белке Е) для Балтийской и Южно-Сибирской соответственно. Изучение эволюции ВКЭ сдерживалось главным образом невозможностью средствами только анализа генетической изменчивости выделить наименьшую структурную единицу вирусной популяции. Однако выход был нами найден благодаря вычленению в популяциях ВКЭ групп штаммов объединенных общими генетическими и фенотипическими признаками. Ранее мы называли такие группы штаммов кластерами, однако в силу многозначности этого термина, мы были вынуждены предложить новое название и в настоящее время такие группы штаммов называются кластеронами. 

Определение понятия кластерон. Кластероном называется наименьшая структурная единица ВКЭ, состоящая из штаммов с идентичной аминокислотной последовательностью фрагмента гликопротеина Е, как правило филогеографически связанных между собой, и имеющих определенный тип территориального распределения.

Минимальное количество штаммов, входящих в кластерон – 3 для ВКЭ сибирского субтипа, и 2 – для дальневосточного и европейского субтипов. Штаммы, чья аминокислотная последовательность встретилась только один раз (в случае ВКЭ-Сиб – один-два раза), относятся к группе «уникальные». Каждый кластерон имеет свое название (идентификатор), состоящее из номера субтипа, которому принадлежит кластерон (1 – ВКЭ-Дв, 2 – ВКЭ-Ев и 3 – ВКЭ-Сиб), и буквенного обозначения, соответствующего аминокислотной последовательности фрагмента белка Е (Kovalev & Mukhacheva, 2013).  

Каждый субтип ВКЭ можно представить в виде набора кластеронов, например, для ВКЭ-Сиб он выглядит так (по имеющимся данным на 2017 год): (Taблица 1)

Как видно из таблицы, в кластероны входит более 80% штаммов. Кластероны различаются по числу входящих в них штаммов: есть крупные, например, в кластерон 3А входит около половины всех штаммов ВКЭ-Сиб, средних размеров, например - 3F, 3D и 3B, а есть кластероны с минимальным количеством штаммов, например - 3O, 3J и 3Q. Большинство кластеронов представляют собой клональные группы штаммов, имеющих общего предшественника, однако в некоторых случаях кластерон может может состоять из двух и более клональных групп (эти случаи будут рассмотрены в другом разделе).

Проведенные ранее исследования показали, что кластеронам свойственен определенный тип территориального распределения входящих в них штаммов ВКЭ. Всего было выделено 4 типа. Локальный тип – штаммы, входящие в кластерон, находятся в относительной близости друг от друга и встречаются только в одной географической локации. Расщепленный –  штаммы, входящие в кластерон с таким типом, состоят из нескольких групп с локальным распределением на значительном удалении друг от друга. Коридорный тип – штаммы кластерона расположены вдоль относительно узкой линии, как правило, вдоль транспортных путей сообщения, при значительном расстоянии между максимально удаленными друг от друга штаммами. И, наконец, диффузный –штаммы располагаются повсеместно на значительной территории без признаков, присущих трем предыдущим типам (Kovalev et al., 2009).

Аминокислотная последовательность каждого кластерона не является случайной, поскольку закреплена у большого количества штаммов, эволюционно и географически связанных между собой. Так, было показано, что кластерон-специфичные аминокислотные замены расположены только на верхней поверхности гликопротеина Е (Рис.1), что свидетельствует об их определенной функциональной роли (предположительно они участвуют  в связывании с клеточным рецептором). 

Рис. 1. Трехмерная модель поверхности гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита (штамм Zausaev). Две субъединицы димера окрашены в розоватый и серый цвет соответственно. Кластерон-специфичные аминокислоты выделены красным цветом.

Изучение влияния каждой из тринадцати аминокислотной замен или их комбинаций на структуру и свойства белка Е у ВКЭ-Сиб является отдельным вопросом, требующим проведения дальнейших исследований. 

В результате появления понятия кластерон стало возможным изучать вирусную популяцию ВКЭ посредством входящих в нее компонентов – кластеронов. Сравнительный анализ размеров кластеронов, их возраста, типа территориального распределения и т.д. дает широкие возможности для решения вопросов формирования и поддержания природных очагов КЭ, изучения эволюции вируса, механизмов и путей появления и распространения ВКЭ. 

Нас часто спрашивают:

Вопрос: Зачем вообще нужны кластероны и кластеронный подход для изучения эволюции вируса, что, нельзя обойтись только одним филогенетическим анализом?

Ответ: Мы много раз в наших публикациях и докладах конференций повторяли: - кластеронный подход - не альтернатива филогенетическому анализу, это всего лишь удобный инструмент для дифференциации вирусной популяции, позволяющий объединить информацию о генотипе (нуклеотидные последовательности) и фенотипе (аминокислотные последовательности) отдельных групп штаммов - кластеронов. Каждый кластерон, будь то кластерон-"основатель" или производный от него кластерон, представляют собой эволюционную единицу ВКЭ, которую удобно изучать с точки зрения ее происхождения, распространения, а также мониторинга природных очагов КЭ.

Вопрос: А как быть с уникальными изолятами ВКЭ, разве отказываясь от них не происходит потеря информации об эволюции вируса?

Ответ: Действительно, примерно, 20% вирусной популяции представлено уникальными изолятами, которые по определению не входят в кластероны т.е. имеют отличную от них аминокислотную последовательность. Однако, следует отметить, что эволюция вируса это всегда эволюция его популяций (в нашем случае это кластероны), то есть групп штаммов в той или иной мере приспособленных к условиям окружающей среды. Уникальные изоляты, это всего лишь девиантные формы вируса, которые появляются в результате ошибок вирусной РНК-полимеразы при репликации вирусного генома. Они имеют низкую приспособленность, что отражается на их численности. Отказываясь от уникальных изолятов, мы упрощаем структуру вирусной популяции, а также освобождаемся от необъективной информации о реальной эволюции вируса.    

Вопрос: Почему для дифференциации вирусной популяции нами был выбран именно белок Е и именно данный его фрагмент?

Ответ. В начале работы перед нами встал выбор – либо применить традиционный подход, связанный с выделением штаммов вируса и последующим изучением их генетических характеристик, либо использовать генетический материал вируса, извлеченный непосредственно из клещей. В связи с тем, что выделение и пассирование штаммов ВКЭ требует особых условий и значительных финансовых издержек, а кроме того, может приводить к изменению генома вируса, было решено проводить изучение генетического разнообразия ВКЭ без предварительного пассирования. Данный подход позволял исследовать большое количество РНК-изолятов вируса, выделенных непосредственно из клещей, животных или клинического материала, с минимальными затратами. Поскольку в данном случае количество генетического материала, доступного для исследования, ограничено, встает вопрос о необходимости выбора информативного фрагмента вирусного генома, достаточного для дифференциации вирусной популяции. В настоящей работе мы остановили свой выбор на гене поверхностного гликопротеина Е. Во-первых, он является основным структурным мембранным белком ВКЭ, который опосредует связывание вириона с клеточными рецепторами, определяет тропизм, вирулентность и обеспечивает образование вируснейтрализующих антител. Во-вторых, ранее было показано, что нуклеотидная последовательность гена этого белка является хорошей мишенью для определения филогенетических отношений как между вирусами комплекса КЭ, так и между субтипами в пределах одного вида вируса. В-третьих, этот участок генома относительно консервативен, но при этом уровень его вариабельности достаточен для калибровки молекулярных часов. Для дальнейшей работы нами был выбран фрагмент гена Е длиной 454 н.п. (номера позиций с 309 по 762 н.п. без участков отжига праймеров), кодирующий фрагмент гликопротеина Е со 104 по 254 а.о. Этот фрагмент был выбран по целому ряду причин: Во-первых, он содержит как консервативные, так и вариабельные участки. Во-вторых, в него входят уникальные аминокислотные замены в позициях 175, 206 и 234, на основе которых выделяют субтипы и филогенетические линии TBEV. Во-третьих, в GenBank около 90% последовательностей вирусного генома включают в себя данный фрагмент, что позволяет работать с максимальным объемом данных. В-четвертых, длина данного участка представляет собой компромисс между достаточной информативностью и возможностью его амплификации (минуя стадию выделения штамма), что позволяет исследовать максимальное количество образцов вируса, полученных за сезон из природных очагов клещевого энцефалита, практически в режиме реального времени. В-пятых, результаты филогенетических анализов, проведенных с использованием выбранного фрагмента генома вируса по своей информативности вполне сопоставимы с таковыми его полногеномных последовательностей.